核磁共振波谱分析_【代谢组学】现代仪器分析技术—代谢组学技术基础及原理...

代谢组学属于组学领域中的一项重要分支，在当前科学研究中备受关注。它主要研究小分子代谢物（相对分子质量小于1000）的数量、种类及其浓度分布等基本特征。通过该技术不仅可以实现对小分子物质的全面定性与定量测定，并且能够揭示代谢物与其所处环境因子之间的相互关系。从基本原理上讲，《现代仪器分析》这门学科为其提供了理论基础框架，在该学科指导下运用波谱分析技术和色谱分析方法构成了代谢组学应用的主要技术手段。这些技术手段的核心目标在于实现物质的有效分离以及物质特性的深入解析。在此基础上我们系统地整理并介绍了代谢组学所涉及的技术基础，并与大家分享了相关信息以助于大家更好地理解和掌握代谢组学及其研究方法

主要内容：

1. 仪器分析技术概念及种类

2. 代谢组学涉及的仪器分析方法

a）波谱分析法 b）色谱分析法

3. 分析仪器联用技术（GC-MS、LC-MS、……）

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1. 仪器分析技术概念及种类

1.1 什么是仪器分析技术

现代仪器分析技术：运用精密或高度专业的仪器装置来测定物质的物理性质、物理化学参数及其变化情况的一种分析方法。通过这一方法能够有效获取物质的化学组成、含量及其结构信息的一类分析手段。

1.2 仪器分析技术的分类

a.波谱分析：紫外可见分光光谱（UV）、核磁共振波谱分析（NMR）、质谱分析（MS ）……

b.色谱分析：液相色谱 、气相色谱 ……

c.物相分析：磁选分析法、比重法、X射线结构分析法……

d.元素分析：电镜能谱分析(EDS)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)……

2. 代谢组学涉及的仪器分析方法

一、波谱分析法

主要原理：光的波粒二象性。

光与物质的相互作用：

•分子能级：分子处于特定的状态，具有一定的能量；

•分子能级跃迁：分子吸收能量从低能级向高能级跃迁；

分子光谱：当分子发生能级跃迁时会获得能量并辐射出特定波长的光子，在不同波长的入射光子中被分子所吸收的现象称为分子吸收入射光谱；相反地，则为分子发射光谱。

光谱成分的划分包括以下几种主要类型：分子振动模式、分子旋转模式、化学键振动模式、电子激发过程、自旋激发态以及同位素核自旋激发态。

1 核磁共振波谱（NMR）

NMR： 该技术用于探究原子核在磁场环境中所处的能量状态以及能量转换过程.—组成结构及分子间相互作用.

基本原理：

原子核的自旋运动：仅当其具有非零自旋值时才对外磁场产生影响，并满足核磁共振所需的条件；

在外部磁场环境中观察到的核动量矩与磁矩的空间量子化现象：当外磁场施加于具有特定磁性特征的原子核时，在强烈外场作用下其能量状态可划分为两个以上能级

核磁共振现象：在此情境下，施加一个特定的能量值（使得它正好等于裂分后相邻两个能级之间的差异），则该原子核将能够吸收这一特定的能量值（这被称为共振吸收）。

从低能量状态向高能量状态跃迁，在射频范围内（频率为0.1~100MHz）所吸收的能量数量，则是属于无线电波领域内的电磁波。因此而言，则是研究磁性原子核对射频能的吸收。

1.1 弛豫过程—谱线宽度

纵向往复（自旋-晶格纵向往复）：具有较高能量状态的核与周围的固体晶格和液体溶剂分子构成的介质之间进行的能量转换过程。

transverse relaxation (spin-spin relaxation) refers to the process where a high-energy spin transfers energy through an exchange mechanism to its adjacent low-energy spin nuclei.

谱线宽度的影响因素：弛豫时间、仪器磁场的均匀性、顺磁性物质。

1.2 化学位移δ

化学位移：原子核所处的化学介质不同会使其受其周围电子层屏蔽的程度产生差异，在此情况下各个原子核会产生独特的共振频率。在不同的磁场环境中或不同的频段位置上会出现特定的吸收峰。

化学位移的数据表达方式：质子间的相对位移是以某个固定物质（如TMS）作为参考基团时，在不同样本中测量到的所有质子共振位置相对于该基团的位置所形成的集合体

1.3 核磁共振仪

仪器的分类：

•射频频率：60MHz，100MHz，600MHz……

•磁体类型：永磁，电磁，超导磁体……

•射频源：连续波、脉冲傅里叶变换……

仪器结构：

核磁共振仪基本结构

波谱示意图

2. 质谱（MS）

质谱法即利用_电场与磁场_对具有电荷的各种微粒进行分类处理，并通过按照其质荷比进行分离并进行检测的技术

应用： 化合物结构、定性和定量化学分析……

2.1 采用质谱法的原因

通过测定离子的准确质量和来确定其化合物组成。由于所有核素的质量值是精确到多位小数，并且没有任何两个核素的质量是相同的之外，并没有一种核素的质量恰好等于另一种核素质量的整数倍。

2.2 基本原理

样本通过质谱仪器进入其内部系统，在其内部离子源区域中被特定的能量电子束作用下发生电离反应。这种电离过程生成分子离子态和碎片离子态粒子。这些具有不同质量和荷荷电比值的离子在质量分析器系统中按照其质量与荷荷电比值的不同顺序依次分离出来。随后经过电子倍增管对信号进行放大处理后即可实现目标化合物的质谱图绘制

2.3 质谱图

横坐标：质荷比

纵坐标：离子强度

离子绝对强度：样本量和仪器的灵敏度

离子相对强度：样本分子结构相关

同一个样品，在特定的电离方式下所生成的质谱图具有高度一致性。这构成了质谱方法在有机定性分析中的理论基础。

质谱示意图

​2.4 MS仪主要结构

MS仪主要结构

二、色谱分析法

一种分离、分析方法；

特点： 有两相—固定相、流动相，两相相对运动。

分离原理： 当一种混合物通过固定相时（fixed phase），会与固定（fixed）发生相互作用。由于流动相（mobile phase）中各组分具有不同的性质与结构特征，在与其接触时与固定之间的相互作用力大小也存在差异性。因此，在相同的推动下（pushing force），不同组分会在固定中的停留时间长短不一（dwell time varies），从而按照先后顺序依次从固定中释放出来（elute in sequence）。

1.1组分分离的影响的因素

1.2色谱的基本理论

A.色谱分配平衡

色谱分配平衡：组分遵循固定相与流动相间的吸附-脱离-溶解-挥发等作用的过程—称作分配过程。当特定温度下组分在两相间达到平衡状态时的浓度比例即为分配系数；而以质量比例表示的比例则称为分配比值。

分配系数：色谱分离的实质。

B. 塔板理论

塔板理论借助于化工中的塔板理论概念推导出流出曲线方程。

精馏塔示意图

将色谱柱类比于蒸馏塔，并将其视为由多个小段构成的一个连续结构体。在每一个微小单元中，一部分空间被固定相所占据而另一部分则被流动相所充满。当组分随流动相穿过色谱柱时，在固定相与流动相之间发生分配过程。假设在每一个微小单元内组分能够迅速地在两相中达到分配平衡状态，则这样的一个小单元则被称为一个理论塔板（theoreticalplate）。每个理论塔板所具有的长度即为理论塔板高度（theoretical plateheight）H值。通过多次的分配达到平衡状态后发现：具有较小分配系数的组分会较早地离开蒸馏塔；而具有较大分配系数的组分会较晚地脱离蒸馏塔系统。由于色谱柱内部拥有大量数量的理论塔板单元存在，在即使各组分之间的分配系数差异微乎其微的情况下仍能实现良好的分离效果

气、固相交换示意图

a）组分浓度与时间的关系：流出曲线方程

**解释的问题 ：**色谱峰图形和最大浓度位置。

b）色谱柱的理论塔板高度为单位柱长度的色谱峰方差

理论层析柱的高度较低，则在相同单位长度内所具有的层析通道数量更多，并从而导致分离效果更加显著。

决定理论塔板高度的主要影响因素包括以下几点：固定相材料的选择、色谱柱结构均匀性、流体组分理化特性和流速等。

c）理论塔板数 &有效塔板数

理论塔板数公式

理论塔板数量受以下因素影响：固定相的种类和性质包括粒度大小以及它们在粒径上的分布情况；填料的状态和结构特征；柱长即填料的有效长度；流动相类型及其流速参数；所采用分析方法及其特性参数。

柱效率

图解法确定理论塔板数

d）塔板理论的特点与不足

塔板理论方程符合色谱流出曲线，为色谱理论提供指导

可采用的有效塔板数和有效塔板高度表征柱的效能。当使用这些参数时，需明确对应特定物质，并注意各不相同的分配系数。

没有阐明影响柱效的本质

•柱效不能表示被分离组分的实际分离效果；

•无法指出影响柱效的因素和提高柱效的途径。

解释不了载气速率对理论塔板数的影响

•无法解释同一色谱柱在不同载气速率下柱效不同的实验结果。

C. 速率理论

速率理论认为：单一分子物质在其内部的运动轨迹需要经历数以千万计的转移过程，并考虑到分子扩散以及其运动路径等多种因素，在色谱柱内其运动轨迹表现为极其不规则的特点，并具有随机性，在柱体中随着流动相前进的速度分布是不均匀的。

速率理论示意图

a）范第姆特方程式（VanDeemeter速率理论方程）

Van Deemeter速率理论方程

b）A—涡旋扩散项

涡旋扩散项

分子扩散项

传质阻力

最佳流速

f）改善柱效的措施

选择颗粒较小的均匀填充料；

在不使固定液粘度增加太多的前提下，应在尽可能低的柱温下操作；

用最低实际浓度的固定液；

用较大分子量载气；

选择最佳的载气流速；采用较小内径和较大曲率半径的柱形。

D. 分离度

分离度：描述物质实际分离效能（塔板理论和速率理论难以描述）。

分离度影响因素：热力学因素（保留值）、动力学因素（峰宽、柱效）。

分离度的情况：

①柱效较高，分配系数较大，完全分离；

②分配系数不是很大，柱效高，峰较窄，基本上完全分离；

③柱效较低，分配系数较大，但分离不好；

④分配系数小，柱效低，分离效果差。

分离度示意图 分离度示意图

1.3 气相色谱（GC）

以气体为流动相的色谱分析方法：

该方法适用于分离分析具有良好挥发性、稳定性良好且难以分解与难以反应的样品；同时特别适用于处理同系物及其同分异构体。

a）气相色谱的基本原理

气相色谱基本原理示意图

b）气相色谱仪（GC）及其主要结构

气相色谱仪主要结构

1.4 高效液相色谱（HPLC）

以液体为流动相的色谱法；

适合于分离高沸点，热不稳定，离子型的样品。

经典LC：分离手段；HPLC：分离和分析。

基本原理： 色谱体系中各组分处于相对运动状态，在互不混溶的两相之间发生交换作用；其中处于相对静止的一方为固定相（体系中），而处于相对运动的一方则为动态相（体系中）。通过利用吸附作用、分配作用、离子交换作用、亲和力作用或分子尺寸等微小差异性，在两相间进行连续多次的质量交换作用（体系中），从而实现各组分的有效分离（体系中）。

四种类型： 吸附色谱，分配色谱，凝胶色谱，离子色谱。

a）液相色谱仪主要及其主要结构

液相色谱主要结构

3. 分析仪器联用技术（GC-MS、HPLC-MS……）

3.1 分析仪器联用技术概述

联用分析技术：综合运用多台不同分析仪器的技术，在实验过程中实现快速精准的检测手段

该色谱体系的主要特点是能够将复杂混合物分解为独立成分；然而，在定性和结构性分析方面存在不足。

质谱等技术对一个纯组分结构确定较为容易。

分析仪器联用形成对混合物质的完整分析。

3.2 分析仪器之间联用的重要问题

接口问题，其一般要求如下：•可进行有效的样品传递；

•样品传递要有良好的重现性；

•容易满足两个仪器任意选用的操作模式和条件；

•样品通过接口不发生化学变化；

•不影响仪器效能；

•样品经过接口的速度尽可能快；

•接口本身操作简单、方便、可靠。

3.3 气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术

综合GC和MS的有点，具有GC的高分辨率和质谱的高灵敏度、强鉴别能力。

适宜小分子，易挥发，热稳定，能气化的化合物；

用电子轰击方式（EI），得到的谱图可以跟标准谱图库比对。

3.4 高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）联用技术

液质联用（LC-MS）可以解决如下几方面问题：

•不会发化合物分析测定；

•极性化合物的分析测定；

•热不稳定化合物的分析测定；

•大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；

•没有商品话的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析图谱。

要解决的重要问题：

•液相色谱流动对质谱工作条件的影响；

•质谱离子源的温度对液相色谱分析源的影响。

3.5 GC-MS & LC-MS 联用技术仪器的主要结构

GC-MS & LC-MS 联用技术