宏转录组方法_8个样本发9分PNAS：宏转录组 PK 宏基因组

本文探讨了人体微生物群的研究，并通过收集8名健康受试者的口腔（唾液）和粪便标本进行了分析。研究采用三种不同的保存方法（冷冻、乙醇、RNAlater）分别对粪便标本进行处理，并结合同一体内的不同部位样本进行分析。结果显示：
不同保存方法对微生物群组成、宏基因组和宏转录组的影响较小；
口腔微生物大部分无法在肠道存活；
酵母菌等少数物种能够在两种环境中共存；
宏基因组的信息较为稳定；
宏转录组的变化较大且更能反映实时功能；
在个体间稳定性方面：宏基因组 > 宏转录组 > 微生物群落；
RNA水平上的变异通常大于DNA水平上的变异。
文章还指出，在人体中使用基于RNA的测序（如MetaPhlAn）进行功能注释比基于DNA的测序更为有效，并提出了构建联合分析框架的可能性。

导读

以下是改写后的文本

一、介绍

1. 摘要：

尽管在人体微生物群组成方面的研究已取得显著进展，但其复杂性仍未完全揭示清楚。具体而言，在人类肠道中存在大量未被充分探索的关键菌种及其调控网络。这一挑战主要源于获取大规模适形样本以支持功能分析的技术限制。为此我们制定了一个前瞻性队列研究方案：首先，在多个体的不同部位采集样本；其次采用冷冻法、乙醇法以及RNAlater三种不同的保存方法；最后较早开展人体宏基因组与宏转录组联合分析的研究工作。内容一：从健康受试者中采集粪便和唾液样本共8份，并分别使用冷冻法、乙醇法和RNAlater三种不同方法进行样本保存以评估不同收集与保存方法对微生物群组成及代谢特征的影响。内容二：对同一受试者的口腔与肠道样本进行同步测序分析以探讨两者之间的关系机制。内容三：通过单个标本进行多点位测序数据分析以比较其在肠道中的分布特征及其对应的代谢变化情况

2. 文章简介

Title：Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut

标题：人体肠道中的宏基因组与宏转录组

发表杂志：PNAS，美国科学院院报

影响因子：9.58

通讯：Curtis Huttenhower

单位：哈佛大学生物统计学系

时间：2014年

3. 通讯作者简介

Huttenhower教授任职于哈佛大学公共卫生学院生物统计学系及免疫生物学与感染性疾病实验室，并担任Broad研究所研究员一职。近五年间，在《Nature Methods》《Nature Biotechnology》《Genome Biology》等知名期刊上发表了多篇研究论文，并均作为通讯作者参与撰写和发表。其中，《PicRUSt》这篇论文的引用次数达2820次，《LEfSe》也有高达2712次的引用记录。此外，在其领导下的研究团队还开发了一系列功能完善的在线工具包，其中包括《PicRUSt》《LEfSe》等多个广受欢迎的分析平台。由于这些工具均为网页界面设计并支持多语言操作，在全球范围内拥有众多用户群体尤其是 Windows 操作系统用户能够轻松上手并投入实际应用中去；对于对生化分析领域感兴趣的研究者与学生而言，则是一个不容错过的强大资源库

网页地址：http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/

言归正传，下面一起看这篇文章进行了怎样的研究：

二、研究设计

方法路线.png

获取8位受试者提供的口腔样本（唾液样本）及粪便样本。具体样本处理方法如下：对于口腔样本采取固态保存法进行处理并开展宏基因组测序；而对于同一受试者提供的人均粪便样品，则分为三份分别采用固态保存法、酒精固定法及RNA later固定法进行冷冻保存，并对每一份样品均同步开展宏基因组测序及宏转录组测序分析。通过生信平台开展 downstream 分析时，请注意以下内容：首先利用MetaPhlAn软件完成微生物学特征的物种水平鉴定；其次运用HUMANn工具对获得的基因表达谱及通路调控网络分析数据展开深入研究。

三、研究结果

1. 内容一：标本保存方法对微生物群组成、宏基因组和宏转录组的影响如何？

内容一.png

结果说明：

Spearman相关性检验显示，在采用不同技术保存样本的情况下（如图A所示），群落结构、功能组成部分及其转录调控部分均显示出高度一致性（如图B和C）。其中黑色线条代表各组8个相关系数的均值。通过方差分析进一步考察标本处理的效果发现：1）微生物群组成（如图D所示）和宏基因（如图E所示）未显示出显著性差异；2）小于5%的转录单元在统计学上显示出对其采集方法选择性较强的敏感性（见图F）。

2. 内容二：口腔和肠道微生物群落之间有何关系？

内容二.png

结果说明：

研究8组粪便与口腔标本的宏基因测序数据（结合HMP数据库进行综合分析）。应用Bray-Curtis距离算法对样本进行分类，并结合层次相关性算法对微生物进行分组。图A显示：第一部分揭示了口腔与粪便微生物组成存在显著差异；第二部分发现肠道中丰度较高的口腔微生物其在宿主肠道中的分布并不常见。图B进一步表明：在口腔中具有最高丰度的8种微生态群其遗传物质在宿主粪便中的含量较低且转录活性也非常微弱。通过灰色线段可以看出同一受试者的口腔DNA（淡蓝色）、肠道DNA（深蓝色）及肠道RNA（红色）之间的关联关系。同样地，在图C中D. invisus这种肠道优势菌种也可以在口腔中广泛存在

3. 内容三：肠道宏基因组与宏转录组有何差异？

1)功能丰度差异：

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结果说明：

通过KEGG注释处理后，我们获得了3,292个具有相对丰度高于0.01%的基因条目（KOs）。这些基因型和转录本型KOs在平均相对丰度上具有显著的相关性（Spearman相关系数r=0.76）。图A至图H展示了8种不同的KO分类情况：第一类（红色标记）代表RNA含量高于DNA的情况；第二类（蓝色标记）则显示DNA含量超过RNA的情形；第三类（x轴或y轴上的标记点）表明其中一者丰度为零而另一者的丰度非零。

2)微生物群组成、宏基因组和宏转录组在个体间的稳定性：

内容3.2.png

结果说明：

在个体间变异最大的前10个物种群落显示出最大的丰富度（图A）。宏转录组中的前10个基因家族次之（图B）。而宏基因组中的前10个基因家族具有最高的稳定性（图C）。通过运用Pielou指数和Bray-Curtis指数对三组数据分别进行计算与比较（图D显示均匀度差异显著；图E则展示了多样性的差异），所得结果与前面的结论一致。这表明，在个体间的稳定性排序中：宏基因组 > 宏转录组 > 微生物群落。

3)功能模块在宏基因组和宏转录组之间的稳定性：

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结果说明：

图A、B、C揭示了个体间明显区别的三个功能模块各自包含四个丰富最高的基因在个体间变化的情况

文章看点

看点1：

在冻融、酒精及RNA later三种存储条件下进行的微生物群落、16S rDNA丰度以及mRNA丰度表现出高度一致性；而各处理方法对样本内部的生物特性影响较小。

看点2：

在口腔和肠道环境中存活的口腔微生物数量极为稀少。由于口腔与肠道环境存在显著差异，在人体内能够同时适应这两种环境的人体微生物数量也非常有限。

看点3：

其一）研究发现，在宏基因组与宏转录组中所涉及的生物功能存在高度一致性；其二）从个体间稳定性来看，在此研究中观察到以下结果：个体间的稳定性主要体现在宏观基因组、宏转录组以及微生物群落三个层面，并且个体间的稳定性主要体现在宏观基因组大于宏转录组大于微生物群落；其三）通过分析发现，在该研究样本中多数情况下，部分处于RNA水平上的遗传信息发生变异的数量多于DNA水平上的相应情况。

该研究不仅制定了宏基因组与宏转录组联合研究的具体操作流程和转运方案，并且通过系统性分析深入探讨了人体口腔微生物群及其与肠道微生物的关系。最后深入阐述了肠道环境中不同层次的宏观基因组图谱及其相互作用规律。值得注意的是，在大多数微生物物种中，宏观基因组图谱所携带的信息具有较高的稳定性；尽管其变化幅度较大（尽管其变化幅度较大），但仍能有效反映微生物群功能的即时动态；而宏观转录组图谱虽然具有较大的变化性（尽管其变化幅度较大），但仍能有效反映微生物群功能的即时动态；并且这种图谱类型对于探究这些微生物群在人体、动物、植物以及环境等多个领域中的功能作用机制具有重要的理论意义和应用价值