通过分离菌的胞外代谢组学推断生物结皮中微生物与代谢物关系

研究者往往会对揭示微生物与物质相互作用的关系这一问题极为关注。即哪类微生物摄取并转化哪些有机物，在探讨土壤有机质循环机制、营养组成以及肠道菌群如何调控宿主代谢等方面发挥着重要作用。

代谢组与蛋白组学领域的文献分享

1研究背景

本篇文章的核心研究对象是生物结皮 （biocrusts），它是一种在干旱及半干旱地区具有关键性地位的地表覆盖类型。这种独特的天然有机体由多种微生物（如细菌、真菌和藻类）及其分泌物与土壤颗粒结合形成，并在其结构中包含丰富的有机物质（som）。这些成分不仅支持维持土壤湿度系统的核心功能，并且对促进区域内的微生物多样性发挥着不可替代的作用；此外，在不同类型的生态系统中（如极地、农业和半干旱区域），微生物群落的多样性与其对应的土壤有机物含量之间呈正相关。

现在普遍认为，在土壤生态系统中以微生物循环作用固定的有机物质属于由多种微生物代谢产物组成的复杂体系，并可通过系统地运用土壤代谢组学方法对其特征进行深入分析从而能够推断出微生物与特定代谢产物之间的相互作用关系。

开展代谢组与蛋白组文献的分享，在本研究中

2研究方法

1.分组设置：

实验组 ：4个生物结皮演替阶段（A-D，如图1），5个润湿时间，每组5个重复，共100个样本。

对照组1 ：无菌超纯水（3个重复），可扣除背景噪音。

对照组2为高温高压蒸汽灭菌四次后的生物结皮（发育阶段D期，在五个不同时间的润湿状态下分别进行三次重复测定），其设置旨在消除可能由非生物因素引起的代谢变化。

图1 生物结皮的四个阶段

2.研究方法：

该研究涉及以下三个关键领域：代谢组学（具有5个生物学重复）、宏基因组学（仅1个生物学重复）以及转录组学（相关研究数据）。

3.检测平台：

实验组：正模式: Q-TOF； 负模式: QE ；

对照组2：（正负模式）QE

宏基因组： Illumina HiSeq 4000

4. 数据分析：

Matlab R2016A: 多元变异数分析及事后检验；R: 斯皮尔曼相关性及其确切二项式检验；KEGG pathways.

5. 实验流程：

图2 实验流程图

为了便于理解起见，请注意特定标记的Exometabolomics这一技术方法是本人实验室的研究人员于2016年在《Nature Communications》上发表的一篇研究论文，在此对这一研究进行简要介绍以便更好地理解本文的核心内容。

2016年的文章要点：

在生物结皮样本中进行分离培养以获得不同种类的微生物样本。其中包含一种特定的鞘藻属光合自养型微生物以及六种异养型微生物。

（2）通过对比分析生物结皮及其胞外代谢产物与特定微生物群系之间的相互作用变化情况,发现其中大部分关键组分得以成功转移至培养基环境中（而其胞外代谢产物则主要通过分解作用进入当地的土壤生态系统,如图3所示,绿色区域代表细胞提取物中的代谢组分,蓝色区域则对应于基本培养基中的代谢产物）。从而使得这种特定类型的微生物群系能够更为真实地模拟其在生物结皮生长环境中的功能行为机制。

图3展示了Microcoleus vaginatus PCC 9802细胞提取液与基本培养基代谢物之间的对比分析

（3）将基本培养基分为不同组别，并向每组加入上述鞘藻属菌体的细胞提取物以及6种异养型菌的细胞提取物以模拟生物结皮生长所需的环境条件；随后将每一种异养型微生物单独接入到相应的培养环境中进行生长繁殖；最后通过代谢组学蛋白组学文献分析的方法比较空培养基与被微生物处理后的培养基中的代谢谱数据；当所测物质在未被微生物摄取前后的检测值对比时（即未接种前与接种后），若所测物质仅在微生物处理后才出现显著增加，则认为是该微生物群落对这些物质有特定的影响；反之若所测物质仅在未被微生物处理时就已存在较高的水平，则判定为该微生物群落对该类物质具有抑制作用；从而建立并验证了这6种异养型菌与相应代谢物之间的相互作用关系

3研究结果

代谢物伴随润湿时间和演替阶段的变化而呈现规律性变化，并且相较于演替阶段而言，在影响代谢物变化的程度上以润湿时间为先驱

图4 生物结皮中的代谢物分布类型

在分析不同润湿时间和演替阶段中物质的聚类发现后可知 研究对象中的物质通过聚类分析 在不同润湿时间和演替阶段中展现出明显的分类特征

Cluster1：主要由脂肪酸组成，在不同的演替阶段中，其早期含量最高，并且随着时间推移而逐渐减少。

Cluster2主要由极性氨基酸及核苷酸碱基组成，在3分钟至18小时内其含量较高，并随后逐渐减少；

Cluster3：在比较晚的时间点及较成熟的生物结皮中累计较多。

为了评估润湿时间和演替阶段两个因素对代谢物变化影响程度的大小，在完成了相关研究后（如图6所示），研究者们进行了深入的数据分析。结果显示，在第一主成分方向上，润湿时间能够更加显著地区分各组样本；而不同演替阶段则主要体现在第二主成分方向上有显著区别。这些分析结果进一步证实了我们对于变量重要性排序的选择是合理的，并且验证了该方法的有效性。

图5 PCA得分图

2. 由于生物活性造成的不同演替阶段代谢物的动态变化

为了探究这些物质的变化中哪些受生物活性影响的研究者对比了不同演替阶段、不同润湿时间和高温灭菌条件下的物质变化情况。结果显示，在至少一个阶段表现出显著差异的有53种（图6中标记为"*"），其余则可归因于非生物因素的作用。

图6 与高温灭菌组相比活性生物结皮中代谢物的动态变化

本研究采用metagenomic方法系统性地推断microbial communities的结构特征，并探讨了wetting duration及不同successional stages对这些结构特征的影响

在完成代谢物的初步分析后, 作者采用了宏基因组测序方法. 然而, 物种注释的技术则采用更为稳定可靠的核糖体蛋白基因来进行物种注释, 而相比之下是基于16SrRNA基因测序. 相较于16SrRNA基因为基础的测序方法, 核糖体蛋白基因为基础的技术具备以下三个显著优势:

核糖体蛋白基因在几乎所有基因组中都作为单拷贝存在；

宏基因组数据集中组装效果好（通常优于16S rRNA基因）；

保守性好并且产生了更高分辨率的系统发育树。

表1 生物结皮宏基因组中识别出的17种核糖体蛋白基因

作者从组装的基因中筛选出共定性鉴定出 17 个核糖体蛋白基因（见表 1），其中 L₁₅ 核糖体蛋白群体具有最大的覆盖范围，在 466 个物种中占据主导地位；因而选择该群体作为物质标记指标进行丰度计算研究。通过分析微生物群落结构的变化发现：蓝细菌门在不同时间点上对环境条件的适应能力呈现出明显的动态特征，在最初的 3 分钟内其相对丰度从约 20-28%降至约 2%，而在随后经过约 49 小时后又回升至约 3%-4%，呈现出明显的两极化变化特征；而厚壁菌门则表现出相反的趋势，在最初的短时间内相对丰度从约 4-5%增长至约 20-39%，随后稳定下来基本未受影响；其他类群如放线菌属与变形杆菌属等则基本未受影响

图7 不同润湿时间和不同演替阶段微生物群落分布（门水平）

4.组装rplO基因与分离培养菌体rplO基因比较

为了解本研究中生物结皮中微生物与代谢物的关系, 依据前面所述16年文章微生物与代谢物的关系作为参考, 研究者采用了宏基因组测序所得rplO基因序列与其在16年文献中分离培养菌株的相应rplO基因序列进行比对分析的方法, 并筛选出具有序列相似度大于86%的细菌物种, 计算得到这些细菌群落具有较高的AN值, 并且其中有四种细菌物种与其在先前文献中的分离培养对象具有较高的亲缘关系（见表2）。值得注意的是, 在所分析的所有细菌群落成员物种中, 这四个代表性物种占总数量的比例超过了30%, 属于显著的优势物种群。

表2 分离培养的菌体与其对应生物结皮中亲缘关系较近的菌种

对比了过去16年的代谢数据及其本次研究的结果。结果显示共有32种物质被共同鉴定出来；其中有9种是由于非生物因素引起的干扰物；经筛选剩下23种独特的化合物用于后续分析；通过对这些化合物峰面积的研究，并将其与其他微生物群落的研究结果进行对比分析；其中被消耗的化合物与其对应的菌群数量呈负相关；而被合成的新化合物则与其对应的菌群数量呈正相关（如图8所示）。运用Spearman方法进一步揭示了48种化合物-菌群之间的相互作用关系；其中约70%的数据符合预期的结果。

图8 生物结皮中微生物与代谢物的预期关系

通过构建食物网的形式展示该关系可见图9，在这幅图中红色实线标记了该物质的释放途径（即被释放），而蓝色实线则代表了物质被消耗的情况（即被消耗）。其中红色实线标记的微生物与代谢物之间的相互作用模式与2016年研究结果基本一致（即存在一致性），而蓝色实线所代表的关系则显示存在差异（即不一致）。此外，在代谢组学和蛋白组学相关的文献分享中，并绘制了C阶段三种菌群丰度在不同润湿时间点的变化曲线（如图所示）。从结果来看，在润湿初期Microcoleus sp.（鞘藻属）的种群密度显著上升，并随着润湿时间延长逐渐将胞内物质释放到环境中。在此过程中，芽孢杆菌Bacillus sp. 1（芽孢杆菌1）和Bacillus sp. 2（芽孢杆菌2）开始利用环境中积累的这些物质，并且其数量也逐渐增加起来；与此同时，在这一过程中Microcoleus sp. 的种群密度却呈现下降趋势。这些观察结果表明Microcoleus sp.作为初级生产者，在生态系统中主要依赖异养微生物获取营养

图9 三种生物结皮中主要微生物的食物网

注释：Blastococcus sp.因对润湿作用的影响并不明显而未被显示于曲线图中。

5.转录组验证

进一步验证了上述结果。研究者通过对其他学者所做生物结皮（与本研究取样地点一致）的转录本数据进行了KEGG通路数据分析，并发现大部分氨基酸合成途径均有所增加；仅有少数氨基酸的分解代谢有所变化（见图11）。此外，在代谢组和蛋白组学文献分享的基础上，在代谢物聚类分析（见图1）中cluster2的主要特征为氨基酸类物质，并且在润湿早中期阶段含量相对较高。

图10 M. vaginatus 基因表达随润湿时间变化情况

4结论

大部分土壤代谢物在润湿事件及生物结皮发育阶段表现出与四种优势细菌之间的预期关系（正相关或负相关）。

代谢组学和蛋白组学文献分享平台的研究表明，在功能分析框架下成功整合了三种技术：即通过研究发现，在揭示微生物群落结构及其功能特征方面实现了对基因水平信息的有效整合。该研究不仅揭示了土壤微生物及其化学环境之间的联系，并且深入探讨了在复杂生态系统中如何通过胞外代谢途径维持生态系统的稳定性和适应性。