【单细胞测序】一、单细胞测序技术总结
文章目录
- 一、 单细胞测序技术简介
- 二、单细胞测序优势
- 三、单细胞测序原理
一、 单细胞测序技术简介
**单细胞测序技术（single cell sequencing）**是一种在单个细胞水平上进行基因组、转录组及表观组高通量分析的技术，在克服了传统高通量测序方法的一些局限性后，并能够阐明单个细胞内的基因结构及其表达状态，并展示不同细胞之间的异质性特征。
我们常见的scRNA-seq实际上是single cell RNA-seq这一技术的一种常见缩写形式。
该图展示了单细胞发展过程及其研究进展趋势。以时间为横轴、样本数量为纵轴构建了坐标系。观察发现：单细胞测序技术自2009年起逐步发展，在初期仅能完成单一样本的分析工作；经过多年努力现在已经实现了对上万个样本的同时处理能力；在这一过程中也不断涌现一批新兴技术
二、单细胞测序优势
(1)解决样本量太少无法进行常规测序的问题
(2)解决细胞间异质性问题
(3)避免PCR扩增偏好性问题
关于单细胞测序的这三个优势，其中第二个提到的比较多，大部分关于单细胞测序的介绍都会提到。第一点很好理解，所以这里也只介绍一下第二点和第三点。
单细胞测序解决细胞间异质性的问题，也是单细胞的主要优势，因为它是基于单细胞水平的测序，所以它相对于之前的bulk RNA-seq，它能捕获每个细胞内的基因表达情况，而不只是一块组织或一个血样所有细胞内基因的平均值。
此图依然能够阐述这一问题。Bulk RNA-seq其本质就是将全部细胞混合在一起后直接测定其遗传信息，并因此只能获取各基因在整体样本中的平均表达水平。相比之下单细胞测序技术则通过将样本分离开来实现了对各个体细胞层表达状态的具体捕捉。它的显著优势在于能够提供每个基因在不同个体或不同发育阶段的具体表现数据。第三个显著优势在于单细胞测序技术的优势。我们知道，在许多实际应用中都需要经过PCR扩增才能获得足够的序列量进行分析. 但在这一过程中不同核酸序列由于其自身的特异性在相同的实验条件下可能表现出不同的扩增效率. 一些特定的序列可能具有较高的扩增效率而另一些则可能效率较低. 这种差异会导致最终得到的结果与原始样品存在一定的偏差. 而单细胞测序技术则避免了这一扩增过程中的潜在偏差.
三、单细胞测序原理
（1）10X Genomics单细胞测序原理
请看下图所示为10X单细胞测序技术的工作原理图。首先需要明确的是，尽管单细胞测序（scRNA-seq）与传统的Bulk RNA-seq测序在测量目标上存在差异（并非基于不同测序技术），但它们均采用了二代聚丙烯酰胺（PAM）技术作为基础测定平台。两者的显著区别主要体现在前期对样本的处理阶段上。
在凝胶微珠表面覆盖了一层短的核酸序列。这些短的核酸序列由四个组成部分构成：R1、10X Barcode、UMI以及富集T（胸腺嘧啶）的部分是Poly(dT)VN序列。其中富集T（胸腺嘧啶）的部分是Poly(dT)VN序列。当RNA释放出来时，在RNA3'末端带有polyA尾巴的情况下与凝胶微珠上的poly(dT)VN部分结合；每个RNA连接到一个特定位置上。每个Gel Beads上都预设有多段特殊序列，在此我们以红色框选中的一段为例进行说明
Read1是上游引物。
10x barcode 是一段 16nt 的核苷酸序列（其对应的理论空间规模为 350 万），且在每一个 gel bead 中所使用的 barcode 序列均为一致设定。随后将该 bar code 与宿主细胞完成融合反应生成水凝胶微球后，在后续步骤中能够确保所有基因组成员均携带同一 bar code sequence。因此我们常用术语是将该技术视为一种用于标记单个细胞的独特手段。
该特定核苷酸序列长度为12nt，在单个Gel Beads中所具有的独特性使其拥有约一百万种可能；然而，在Gel Beads内部的情况与此不同。其可用空间极为宽广，并且即便同一 mRNA 分子具有多个标签也会因为其数量远超可用空间而无法满足需求；因此，在实际检测过程中每一个 mRNA 分子都会被唯一标记。
在UMI的作用下实现了绝对定量，在这种情况下由于不同mRNA具有不同的扩增效率即使两个起始mRNA具有相同的表达水平经过多轮扩增我们可能会误判它们的实际差异性。通过在起始样本中附加独特的标识符（UMI）我们可以根据扩增后不同UMI的数量来确定原始样本中的基因表达水平。
PolyT用来匹配PolyA，以捕获mRNA。
