空间多组学分析破译胶质母细胞瘤中的双向肿瘤-宿主相互依赖性（空间微环境）

作者，追风少年i

到了周四。快到下周了。今天分享一篇关于空间多组学分析的文章，在[https://links.jianshu.com/go?to=https://www.10xgenomics.com/resources/publications/refinementList[productGroups][0]Spatial Gene Expression for Fresh Frozen Frozen tissue](https://links.jianshu.com/go?to=https://www.10xgenomics.com/resources/publications/refinementList[productGroups][0]Spatial Gene Expression for Fresh Frozen Frozen tissue)中提到《深入解析胶质母细胞瘤》的研究表明肿瘤与宿主之间存在双向相互依赖关系。（具体摘要内容）不可否认的是目前的研究大多基于大规模样本数据支持这一发现。

Graphical abstract

summary，肿瘤细胞的异质性是由于局部环境的异质性

胶质母细胞瘤是一种中枢神经系统的恶性肿瘤，在其发展特征中体现出高度的亚克隆多样性以及动态适应性特征。在这些肿瘤的空间背景下动态重组的来源尚不明确，在这种情况下通过应用空间分辨技术结合转录组学、代谢组学以及蛋白质组学的方法来表征这一疾病特性。通过对患者间区域共享转录程序的研究推测出胶质母细胞瘤是由谱系状态的空间分离组织所引发的，并且能够适应于炎症环境及/或代谢刺激的作用机制这与成熟星形胶质母细胞发生反应性的转化过程存在一定的关联性。通过整合代谢成像技术和流式细胞术实现了对局部区域肿瘤宿主相互依赖关系的研究从而揭示了空间特异性适应性转录程序的存在性研究结果表明染色体变异程度的变化与反应性转录程序相关的亚克隆存在明显的空间凝聚特征这暗示着当环境受到压力时会引发相应的选择压力（环境选择）。通过将人类以及啮齿类动物的新皮质组织植入到干细胞培养体系中模拟不同环境条件下的情况研究发现只有当基因表达状态发生相应调整时才能维持疾病特性的稳定性这一发现进一步验证了对环境变化进行动态适应的重要性

INTRODUCTION（空间多组学的必要性）

单细胞技术为健康人脑和恶性肿瘤中单个细胞的转录调控及动态演变提供了深入见解

RESULTS

Atlas of spatially resolved transcriptomics in glioblastoma

从28个胶质母细胞瘤材料库中收集了跨越不同年龄组及解剖区域的高通量空间转录组图谱数据共88793份，并结合基质辅助激光解析电离(MALDI)及成像质谱流式 IMS 技术对空间代谢组学与蛋白组学进行了深入分析研究如图所示

图1. 工作流程及空间数据集所用分析方法示意图

为了解决空间转录组的精度问题，文章提到了两种方式：

A machine learning-based segmentation approach is employed to determine the precise count of nuclei per spot.

识别每个spot的细胞数

a artificial neural network (ANN) model designed to forecast the number of tumor cells per spot, based on a simulated dataset derived from randomized cellular assemblies obtained from paired st-/scRNA-seq datasets (n = 5). (also a method we commonly employ)

单细胞数据模拟多细胞spot

为了使结果能与组织学分类的普遍黄金标准相结合, 根据常春藤 GAP 组织学分类系统预测了逐 spot 组织学表型（这样的逐 spot 分析工作对于普通研究者而言确实是一项挑战）

The cases among various degrees of resolution for histologically defined regions.

相较于组织病理学特征而言，在具有较低的肿瘤细胞频率的样本中主要包含浸润区，在此区域内来自健康皮层的肿瘤细胞不易观察到

Deciphering spatially resolved transcriptional heterogeneity

本研究旨在通过将所选样本与其现有转录分类及组织学分类建立关联性来识别反复出现的转录空间模式。（因此，在采样过程中被移除的所有含有肿瘤细胞较少的spot都被排除在外）。对于GBM（胶质母细胞瘤）中基因表达亚群的空间定位问题仍存在诸多疑问：我们发现其他研究者曾人为认为这些基因表达亚群在空间上是分离的，并且在肿瘤内部发挥着不同的功能作用。为了彻底解决这一问题——即如何消除空间上的转录异质性——首先必须搞清楚如何实现这一点，并将其结果整合到整个研究队列中。为此我们采取了系统性的策略：首先消除了混杂因素的影响（包括患者间变异性和技术干扰以及测序深度差异），随后整合了患者间的时空加权相关矩阵（逐个聚类），接着进行了层次聚类分析——最终确认了五个具有显著差异性的重复出现的空间特定基因表达程序彼此分离。（这种方法使得我们得以深入理解在整个样本群体中具有稳定特异性特征的所有基因表达程序所对应的生物学意义）其中，在90%以上的样本中都包含了五个高度一致且稳定的基因表达程序群：其中包括与缺氧反应及糖酵解相关的一组基因；标志少突胶质母细胞的一组基因；富集于放射状神经胶质细胞或者炎症相关的另一组基因；以及一组与神经发育相关的特定基因群。

探索空间表达模式

识别空间转录转录程序主要分为以下三个步骤 ：

• Determination of patient-specific, robust, and regional gene expression modules.
• Horizontal integration across patients based on shared gene expression modules as anchors and employing spatially weighted correlation analysis to investigate the colocalization patterns.
• Analysis of the spatial organization within shared gene expression modules.

Heatmap of spatially resolved transcriptomics of glioblastoma

A heatmap illustrating the spatially weighted correlation analysis for 99 unique transcriptional programs was generated. Hierarchical clustering employing Ward D2 and Calinski's method verified the presence of 5 clusters characterized by significant spatial congruence. The proportion of programs per patient contributing to each cluster was displayed on the left side.

This spatially weighted correlation analysis is used to examine the relationship between enrichment scores and spatial overlap of current transcriptional signatures. Through clustering all signatures, three main clusters are manifested: glia-like clusters, neuronal-like clusters, and stress-response reactive clusters. Signatures with high cross-correlation are highlighted by connecting lines.

在空间层面上的转录状态不受细胞周期状态的影响，并与现有分类体系保持一致

空间上不同的转录程序和亚克隆结构

染色体数目变异（CNAs），包括癌基因局部扩增或肿瘤抑制因子丢失等特征，在恶性细胞中具有显著性表现。这些变异与特定细胞状态密切相关，在缺氧反应类别中发现作为独立亚克隆事件显著积累出现的CNAs特征。研究发现，在基因组层面观察到变异的同时，在空间上也表现出不同的转录活动模式之间的关联

the workflow for copy number analysis

Validation of CNA Analysis

不同染色体组内基因表达特异性的热图显示了空间区分性转录子亚群间的差异性CNA分布。在热图的下方条带状图表中我们量化了仅出现在定义的空间区分性转录子亚群中的独特亚群所占的比例。通过条带状图表我们描绘了不同空间区分性转录程序中出现的独特CNA事件数量。统计学显著性采用Mann-Whitney U检验进行评估并且通过Bonferroni校正方法对多重比较结果进行了修正

进一步探讨在肿瘤内部是否存在遗传亚克隆与其所处的空间位置上的不同表达模式之间的直接关联？

Transcriptional subgroups are not influenced by the subclonal architecture.

基于胶质母细胞瘤（GBM）中的应激响应机制所涉及的代谢变化（在涉及空间代谢组学领域目前仍处于探索阶段）

为了进一步探索空间上不同的反应性缺氧模式, 研究者采用空间代谢组学方法从连续用于 stRNA-Seq 的组织切片 (患者样本数量为6) 中提取了相关数据. 该研究开发了一个类似于stRNA-Seq 代谢谱的工作流程, 通过降维分析发现前两个主要成分之间存在显著差异, 并最终确定出三个具有代表性的稳定性的校正后代表型. 功能性 通路分析结果表明, 第一 个 通路 (M-G1) 显著富集于磷酸戊糖途径; 第二个代表型 (M-G2) 显著富集于磷酰胆碱通路; 最终 的第三个代表型 (M-G3) 在糖酵解以及氨基多糖合成通路中表现出高度富集特征.

在作者的综合分析框架下（WNN聚类），空间不同转录程序表现出对反应性缺氧的独特响应，在组织学层面观察到大部分与该响应相关的斑点特征指向坏死边缘区域。研究者推测，在空间隔离的不同生态位环境中积累发生低氧代谢过程会导致基因组不稳定性的潜在来源。这些具有特征性的'反应岛'区域象征着可能源于原始基因组变异的关键转变方向，在此过程中肿瘤细胞发展出抗治疗敏感性能力。

深入研究具有显著反应性缺氧特性的区域。该区域被明确界定为具有高度缺氧特征，并显著富集了糖酵解相关的代谢途径。进一步观察到染色体组8p、9p、13q、19q及21q表现出独特的缺失和增强特征。这种遗传变异可能源于该区域内的单一亚克隆事件。这表明，在基因组稳定性方面，与氧气水平相关的代谢过程可能扮演着关键角色。

This method synthesizes spatially resolved metabolomic and transcriptional data.

反应性缺氧区域积累染色体改变

本研究对TCGA数据库中的GBM患者样本进行了系统性分析（其中IDH1/2野生型患者共计357例）。通过_missing氧气基因表达水平进行分组后发现，在低氧条件下表现出明显特征性的肿瘤细胞群具有更高的突变率和侵袭性特征。通过对这些患者的染色体学检测发现，在缺氧驱动肿瘤中染色体变异率显著高于对照组（p<0.05）。结果表明，在低氧条件下诱导的细胞群具有更高的突变率和侵袭性特征，并且这种变化趋势在亚克隆选择的支持下能够更好地维持脑胶质母细胞瘤的微进化状态以恢复其弹性特性（图1）。为了进一步验证假设模型的准确性，我们对来自不同患者的正常组织与癌变组织切片进行了详细的分子表型分析（n=48），结果显示癌变组织中高度缺失氧气的状态与较高的突变率呈正相关关系（r=0.78, p<0.01）。此外，在长期随访中发现，在接受治疗期间处于低氧状态的脑胶质母细胞瘤患者的预后状况明显优于同期手术切除后恢复正常供能水平的患者群体

研究者通过探究常氧与缺氧条件下CpG位点cg12434587和cg12981137处的O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)启动子的甲基化状态变化，在探索缺氧代谢对DNA甲基化调控机制方面取得了进展。在细胞系中发现，在常氧条件下具有未被甲基化的MGMT启动子会经历高水平的Methylation，在缺氧条件下则表现出显著的高Methylation特征。这些发现进一步支持了代谢驱动型染色体易位(CNA)假说，并揭示出大多数重组事件被认为是随机发生的，并有助于肿瘤亚克隆化的进程。

TCGA and cell culture verification of hypoxygenation-related chromosomal number alteration

低氧代谢调节GBM中的“去或成长”潜力

在对空间分辨转录程序的初步表征中，在非循环细胞中反应性缺氧程序明显富集。这一现象表明缺氧应激能够引发细胞周期的停滞现象，并且推测由缺氧驱动导致的S期停滞有助于积累基因组不稳定性

GBM 细胞的基线转录状态可以分配给“发育”（AC-、OPC-或 NPC 样）程序。在空间上，代谢谱显示磷酸戊糖途径 (PPP) 的富集。由于增殖和肿瘤生长，会发生越来越多的营养和氧气缺乏，迫使采用代谢程序进行糖酵解。这种现象是 PPP 和糖酵解之间的相互转换，与肿瘤细胞的生长或生长潜力有关，表明 PPP 支配着由生长的肿瘤细胞组成的区域 。

在缺氧发生时，在氧气不足的情况下（或当低氧状态出现时），这种低氧条件下的糖酵解转换随后发生。这有助于促使细胞逃离/迁移至含氧正常的区域。由于缺氧条件下细胞周期相关程序的下调会导致S期停滞，并引起CNA（染色质非紧缩区）积累。研究者推测其中大部分这些受缺氧影响的细胞随后会进入凋亡状态，在脑胶质母细胞瘤（GBM）中表现为特征性坏死现象。然而只有少部分细胞通过上调与迁移相关的转录程序得以逃脱这一困境。此外研究表明其他压力因素（如辐射或化疗）也会引发脑胶质母细胞瘤出现与其相关的功能紊乱

基于此模型

Illustration of the hypoxia-stress concept and escape mechanism

探索反应性免疫区域的肿瘤-宿主相互依赖性

通过识别反应性免疫和反应性缺氧规划区域内的ROI，并从神经元分化的区域中调节ROI的位置与范围。通过上述操作获得的是一个包含了82,179个细胞的空间白蛋白组学图像集合。

作者的研究表明，在归类为反应性免疫区域中的骨髓细胞和淋巴样细胞具有显著特征。为了深入探讨免疫富集区域肿瘤细胞的分化情况, 作者将这些细胞性别为放射状胶质细胞（EGFR + HOPX +）、反应性免疫（EGFR + CHI3L1 + VIM +）、空间 OPC（EGFR + OLIG1 + )、神经发育(EGFR + SNAP25 + CALM2 + ) 和反应性缺氧 (EGFR + VEGFA + )等亚群.其中, 在 EGFR 驱动下的 CHI3L1 和 VIM 共表达亚群仅在通过转录定位法确认其存在

为了进一步补充关于免疫系统与GBM（胶质母细胞瘤）之间复杂细胞关系的研究发现，在研究团队中作者基于肿瘤细胞与淋巴组织或骨髓组织之间的空间距离评估其间的血管连通性，并成功确认了肿瘤细胞与转录定义的反应性免疫区域内的免疫室室之间显著增强了的相互作用关系。随后，在深入分析各反应性免疫区域（ROI）中所包含的各种细胞类型及其分布情况后发现，在反应性免疫和缺氧条件下可能存在聚集分布着AC样和MES样特征的细胞群体进一步证实，在反应性免疫和缺氧条件下可能存在聚集分布着AC样和MES样特征的细胞群体。此外，在神经发育相关区域显著富集了一种OPC样的成体神经母细胞（OPC），而在反应性和缺氧相关的区域内则分别观察到显著富集的现象分别观察到显著富集的现象

考虑到 T 细胞在两个反应区域显示出较高的聚集，在研究肿瘤细胞代谢状态及神经系统发育特征时发现，在肿瘤相关免疫活性区域内 PD-1 通路素（CD3^+）水平呈现出显著升高趋势，并提示在肿瘤免疫响应区中存在局部免疫抑制现象增强的现象。此外，在代表 GBM 免疫景观的单倍型转录测序数据集中证实了肿瘤相关浸润区中记忆T细胞和耗尽T细胞均呈现显著聚集趋势

Integration of single-cell mass cytometry

环境条件有助于双向亚型转变

现有研究表明炎症环境通过驱动转路适应机制导致灰质白质病变（GBM）的异质性问题尚存。其可逆性尚不清楚。当将受到微环境调控的肿瘤细胞移植回健康个体的大脑时，观察其转录变化程度。研究团队将源于MES样患者的前体细胞移植至不同年龄段的人类及小鼠皮层组织切片（共培养4天）。在年轻人类供体中观察到OPC-、AC-及NPC-细胞明显增加，在老年供体中出现显著增加的MES样/反应性细胞类型。而在啮齿类动物模型中培养的Gray物质病变相关癌变细胞则表现出富集于MES和AC基因特征的状态。这些发现表明宿主环境在调控Gray物质癌变相关基因表达方面发挥着关键作用

In vitro human neuronal culture suggests a two-way shift in response to environmental influence.

讨论

近年来，在单细胞分析技术方面取得了诸多突破性进展的研究成果已经深刻地改变了人们对肿瘤异质性及其可塑性的认识以及潜在治疗选择策略的认知。然而目前仍未深入探讨脑肿瘤的空间组织重要性在此处作者深入阐明了微环境与GBM（胶质母细胞瘤）转录异质性的时空变化之间存在的双向及单向相互作用机制提供了新的视角。该研究还指出了五个不同空间中的转录程序其共同特征均基于共享的转录特征以及特有的基因组变异这一发现具有重要意义。值得注意的是尽管在GBM中有关CNA（染色体数变异）的研究已有报道但以往并未关注到区域模式与其所对应的转录程序之间的关联关系为此本研究进行了系统性探索并重点比较了细胞状态组织学模式及空间特异性下的转录程序特征

基于空间分辨率的方法多维度刻画胶质母细胞瘤（GBM）特征，在揭示细胞状态动态适应及其在肿瘤微环境中的空间关系方面具有重要意义。研究表明，在S期结束时发生严重缺氧等代谢变化会导致细胞增殖受限，并引起染色体易位的显著积累现象。这一现象已在多种癌症类型中观察到，并充分证明了缺氧条件下基因组不稳定性增强的过程。研究者通过二维细胞培养模型和TCGA数据库分析验证了区域缺氧代谢特征作为基因组不稳定性的潜在储存库作用，并表明其在微进化过程中的决定性作用,从而使得耐药性表型的产生成为可能。

Method

我们主要来关注一下空间的CNV估计

了解SPATA的相关信息，请研究人员参考文章[SPATA](https://links.jianshu.com/go?to=https%3A%2F%2Fwww.medsci.cn/ article/show_article.do?id=c5f920686566 "SPATA")。

CNV分数矩阵的聚类，inferCNV选择subcluster模式会进行层次聚类。

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